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離心機(jī)的使用步驟和使用時的注意事項(xiàng)有哪些 ?

更新時間:2018-01-22      點(diǎn)擊次數(shù):2003
 
    
離心機(jī)是借離心力分離液相非均一體系的設(shè)備。根據(jù)物質(zhì)的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度等的不同,應(yīng)用強(qiáng)大的離心力使物質(zhì)分離、濃縮和提純的方法稱為離心。一般說, 離心機(jī)轉(zhuǎn)速在 20 000r/min 以上的稱為超速離心。離心技術(shù),特別是超速離心技術(shù)是分子生物學(xué)、生物化學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)中*的手段。
   1924 年 T.Svedberg 和 Rinde 研制出世界上*臺渦輪超速離心機(jī)以來,發(fā)展非常迅速,現(xiàn)在已廣泛地應(yīng)用到科學(xué)研究和生產(chǎn)的各個領(lǐng)域?,F(xiàn)在離心機(jī)轉(zhuǎn)頭zui高轉(zhuǎn)速已達(dá) 100000 r/min ,zui大離心力達(dá) 700 000 g 。
   離心機(jī)作為一種手段,具有許多優(yōu)點(diǎn)。例如,超速離心可在低溫下操作,保護(hù)了生物大分子的活性。制備型的離心機(jī)負(fù)載量大,一次可分離提純幾克樣品,比層析、電泳上的樣品量大得多。分析離心機(jī)不僅可測物質(zhì)的分子量,還可檢驗(yàn)物質(zhì)的純度、構(gòu)象、沉降系數(shù)等。因此離心技術(shù)在生物學(xué)研究中占有重要的地位,是分離、純化細(xì)胞、病毒、蛋白、核酸和酶的zui方便zui有效的工具。 
   ( 二 )  離心原理
   當(dāng)含有細(xì)小顆粒的懸浮液靜置不動時,由于重力場的作用使得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重,下沉越快,反之密度比液體小的粒子就會上浮。微粒在重力場下移動的速度與微粒的大小、形態(tài)和密度有關(guān),并且又與重力場的強(qiáng)度及液體的粘度有關(guān)。象紅血球大小的顆粒,直徑為數(shù)微米,就可以在通常重力作用下觀察到它們的 
沉降過程。
   此外,物質(zhì)在介質(zhì)中沉降時還伴隨有擴(kuò)散現(xiàn)象。擴(kuò)散是無條件的的。擴(kuò)散與物質(zhì)的質(zhì)量成反比,顆粒越小擴(kuò)散越嚴(yán)重。而沉降是相對的,有條件的,要受到外力才能運(yùn)動。沉降與物體重量成正比,顆粒越大沉降越快。對小于幾微米的微粒如病毒或蛋白質(zhì)等,它們在溶液中成膠體或半膠體狀態(tài),僅僅利用重力是不可能觀察到沉降過程的。因?yàn)轭w粒越小沉降越慢,而擴(kuò)散現(xiàn)象則越嚴(yán)重。所以需要利用離心機(jī)產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力,才能迫使這些微粒克服擴(kuò)散產(chǎn)生沉降運(yùn)動。
   離心就是利用離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的強(qiáng)大的離心力,加快液體中顆粒的沉降速度,把樣品中不同沉降系數(shù)和浮力密度的物質(zhì)分離開。離心力 (F) 的大小取決于離心轉(zhuǎn)頭的角速度 ( ω , r/min) 和物質(zhì)顆粒距離心軸的距離 (r , cm) 。它們的關(guān)系是: F = ω 2R
   為方便起見, F 常用相對離心力也就是地心引力的倍數(shù)表示。即把 F 值除以重力加速度 g ( 約等于9.8m/s2.) 得到離心力是重力的多少倍,稱作多少個 g 。例如離心機(jī)轉(zhuǎn)頭平均半徑是 6cm ,當(dāng)轉(zhuǎn)速是 60 000 
r/min 時,離心力是 240 000 × g ,表示此時作用在被離心物質(zhì)上的離心力是日常地心引力的 24 萬倍。因此,轉(zhuǎn)速 r/min 和離心力 g 值之間并不是成正比關(guān)系,還和半徑有關(guān)。同樣的轉(zhuǎn)速,半徑大一倍,離心力 (g 值 ) 也大一倍。轉(zhuǎn)速 (r/min) 和離心力 (g 值 ) 之間的關(guān)系可用下式換算:
式中: r 為半徑 (cm) , g 為離心力 (g 值 )
   (三 ) 超速離心機(jī)的離心方法 
   用離心方法分離生物大分子和亞細(xì)胞物質(zhì)的基本原理是根據(jù)它們在液體介質(zhì)中或者沉降速度不同而形成不同的區(qū)帶,或者它們的密度不同而停留在液體介質(zhì)中不同的位置而把它們一一分開。前者是沉降速度法,應(yīng)用該法時液體介質(zhì)的zui大密度要小于樣品中zui小顆粒的密度,離心時選用高轉(zhuǎn)速和短時間;后者是沉降平衡法,應(yīng)用該法時液體介質(zhì)的zui大密度要大于樣品中zui小顆粒的密度,離心時選用較低轉(zhuǎn)速和較長時間。實(shí)際操作有幾種形式:
   1. 差速離心這種方法是選擇不同轉(zhuǎn)速的離心,分別分離各個不同組分。例如先用低速沉降大顆粒和上清液,在高速離心上清沉降中等顆粒,zui后超速離心上清沉降小顆粒。采用逐級提高離心力分離上情液的方法,把不同大小的顆粒分開。
   這種方法比較簡單,方便。分離的組份沉到管底,因此可以迅速濃縮所要的組份,減少體積。但回收率和純度是有矛盾的,要提高回收率,勢必提高轉(zhuǎn)速或延長離心時間,這樣大小相近的顆粒也會沉到管底。因此該法多用于粗提純或初步濃縮樣品。
   2. 速度區(qū)帶 ( 或速度梯度 ) 離心 本法是將樣品放在一個連續(xù)的密度梯度液體上,通過離心,大顆粒沉降快,小顆粒沉降慢。經(jīng)過一段時間,相同的顆粒就在同一深度形成一條帶子,因此把各種組份分開來。它適用于分離密度相同、而大小不同的物質(zhì),如不同的蛋白質(zhì)組份密度都差不多,但分子量不一樣,用本法很容易將其分 
開。但對密度不同、大小類似的物質(zhì)則不易分離。蔗糖梯度是一種常用的介質(zhì)。用不同濃度的蔗糖溶液 (5%-60%) 配成梯度,用于梯度離心。再分別進(jìn)行收集處于不同區(qū)帶里的各個組份。
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